作者： Avinash S, et al.
发表日期：2020年3月
发表期刊：Protein Expression and Purification

研究背景

富半胱氨酸分泌蛋白（CRISPs）是 CAP（CRISP、Antigen 5 and Pathogenesis 1）超家族蛋白中的一个同名支系。CAP 超家族蛋白的成员遍布生物界的各个门类，包括细菌、植物、真菌和动物王国，而 CRISPs 则只存在于脊椎动物中。人类拥有三个 CRISP 基因（CRISP1-3），啮齿类动物拥有四个 CRISP 基因（Crisp1-4）。
CRISP 在哺乳动物的雄性生殖道中高度表达，也是爬行动物毒液中的成分。在雄性生殖道中，CRISPs 几乎在配子发育和成熟的每个阶段都有表达，它们影响精子顶体的发育和功能、精子活力、潜在的受精能力。
CRISPs 通常是分泌型蛋白质，其特征是存在一个 N 端 CAP 结构域，其中包含四个标志性 CAP 矩阵（CAP1-4）、一个铰链区和一个连接的 C 端离子通道调控（ICR）结构域。CRISPs 的相对分子量为 27-31 kDa，含有 16 个绝对保守的半胱氨酸残基，形成 8 个分子内二硫键。CAP 结构域中有 6 个半胱氨酸残基，形成 3 个二硫键，形成一个拟活性口袋；铰链区有 4 个半胱氨酸，形成 2 个交叉二硫键；ICR 结构域中有 6 个半胱氨酸，形成 3 个二硫键 。二硫键的适当形成对 CRISPs 的功能至关重要。由于这种结构的复杂性，以往生产功能性 CRISPs 重组体的尝试一直充满挑战。人们曾多次尝试利用细菌和哺乳动物表达系统表达和纯化全长蛋白质。然而，这些尝试导致蛋白质产量低、重组蛋白折叠错误以及蛋白质被困在不溶性包涵体中。因此，大量 CRISPs 的生产一直是确定其功能的重大障碍。因此，需要一种改进的方案来表达和纯化重组小鼠 CRISPs。由于杆状病毒表达系统具有更强的生产可溶性和天然折叠蛋白的能力，因此被广泛用于生产哺乳动物蛋白。在此次研究中，作者利用杆状病毒表达系统生成了大量可溶性、正确折叠且具有生物活性的小鼠附睾 CRISP4，纯化方案的总产量为每升表达培养液 3.0 毫克纯化重组小鼠 CRISP4。

实验方法

将无血清昆虫细胞系和需要感染的细胞分别培养于Sf-900 II培养基和无蛋白昆虫细胞培养基中，在27°C下以120 rpm持续震荡。随后，将小鼠Crisp4基因克隆到pFastBac-SHEK 载体的特定位置中，与一个His6-标签、一个柔性连接序列和Crisp4 N端的肠激酶（EK）链接位点相接，完成质粒构建。使用杆状病毒表达系统生成Crisp4 bacmid，再使用 Bacmid 载体和基因特异性引物，通过菌落 PCR 进行蓝/白颜色选择和筛选，鉴定出正确整合了 Crisp4 的 Bacmid 克隆。随后使用质粒纯化试剂盒分离阳性克隆以制备 Bacmid DNA，并保存在 4 °C。在 Sf-9 昆虫细胞中瞬时转染重组 bacmid，产生重组杆状病毒，病毒上清液在 2 × 106 Sf9 cells/ml的低感染倍数（MOI）下扩增三轮 72 小时。重组小鼠 CRISP4 在培养上清中表达为可溶性分泌蛋白。为了表达重组蛋白，用扩增的高滴度重组 CRISP4 杆状病毒 5%（MOI 约为 5）株感染2 × 106 cells/ml 先前在无蛋白昆虫培养基中培养的细胞。在 27 °C、120 rpm 的轨道摇床上表达 48 小时。最后收获培养物，并在 4 °C 下以 5,000 g 离心 20 分钟。保留上清液用于蛋白质纯化，弃去细胞颗粒。
含有重组小鼠 CRISP4 的细胞上清液经 0.8 μm 过滤器过滤，浓缩后使用切向流过滤装置对磷酸盐缓冲液（10 mM Na₂HPO₄，500 mM NaCl，pH 7.4）进行重过滤，使用的滤芯截留分子量为 10 kDa。为了尽量减少与树脂的非特异性相互作用，在重滤液中添加了咪唑，最终浓度为 20 mM。然后将重滤液在平衡的 Ni-NTA柱上循环三次，以结合 His 标记的蛋白质。用洗涤缓冲液（10 mM Na₂HPO₄, 500 mM NaCl, 30 mM imidazole, pH 7.4）洗涤 Ni-NTA 柱以去除非特异性结合，并用洗脱缓冲液（10 mM Na₂HPO₄, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, pH 7.4）洗脱 His 标记的蛋白质。将洗脱馏分的样品进行 SDS-PAGE 分析，根据分子量测定，将含有重组 CRISP4 的样品集中起来，用 0.2 μm 针式滤器过滤以去除聚集物，然后用 HiLoad 16/600 Superdex 凝胶过滤层析（SEC）柱纯化。含有 CRISP4 蛋白的 SEC 洗脱液在 1 mL HiTrap Q 高性能离子交换柱进一步纯化。最后，在 SDS-PAGE 上分析从峰值馏分中洗脱的重组 CRISP4 蛋白。用离心浓缩器将纯化的 CRISP4 浓缩并缓冲到 pH 7.4 的 10 mM Na₂HPO₄ 中。用布拉德福德测定法测定纯化的重组小鼠 CRISP4 蛋白的蛋白质浓度，并以小的等分试样保存在 -80 °C。通过 SDS-PAGE 分析 CRISP4 制剂的纯度，并使用小鼠 CRISP4 抗体在 Western 印迹中确认其身份。最后，使用糖蛋白染色法评估糖基化的存在，并使用圆二色性（CD）光谱对纯化后的重组小鼠 CRISP4 蛋白进行分析结构特征。

产品信息

Reference
Avinash S. Gaikwad, Khai Lee Loh, Anne E. O'Connor, Hugh H. Reid, Moira K. O'Bryan, Expression and purification of recombinant mouse CRISP4 using a baculovirus system, Protein Expression and Purification, Volume 167, 2020, 105543, ISSN 1046-5928, https://doi.org/10.1016/j.pep.2019.105543.